電子顯微鏡的誕生和發(fā)展大大推動了人們對微觀世界的研究。借助電鏡技術(shù)，人們可以認(rèn)識亞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)。離體培養(yǎng)細(xì)胞具有活力好、層次薄和易于取材、固定效果好等優(yōu)點(diǎn)，非常適宜于電鏡觀察。隨著電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)今的電鏡技術(shù)已包括了透射電鏡超薄切片技術(shù)與觀察，掃描電鏡樣品制備技術(shù)與觀察，電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，電鏡X射線顯微分析技術(shù)和電鏡圖像立體定量分析技術(shù)等，既可觀察細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，也可了解功能，并進(jìn)行定性與定量分析。
一、透射電鏡細(xì)胞樣品制備技術(shù)和觀察方法
(一)原理
透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)是利用陰極發(fā)射的電子，通過陽極中央的微孔形成的電子束穿透樣品獲得樣品的電子信號，經(jīng)物鏡、中間鏡和投影鏡等多級電子放大至數(shù)百至數(shù)千萬倍，最后成像在熒光屏上便可即時觀察，或是投射到照相底片感光片上作為永久記錄。由于標(biāo)本必須置于高真空中進(jìn)行電鏡觀察，所以電鏡觀察的生物標(biāo)本必須特殊制備，不能含水，離體的生物標(biāo)本要迅速加以固定，以防產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變。另外，電子的穿透力很弱，這就需要把樣品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一個細(xì)胞切成100～200片)。為了使柔軟的生物組織能夠制成這樣薄的切片，并使切片耐受高真空和電子轟擊，所以在切片前要進(jìn)行包埋。超薄切片技術(shù)是透射電鏡觀察成功的關(guān)鍵。
超薄切片制作樣品過程大體分為取材、固定、漂洗、脫水、滲透包埋與聚合、切片、染色等。細(xì)胞超薄切片技術(shù)中如何把細(xì)胞完整無損地從培養(yǎng)瓶皿壁上包埋下來是最大的難題。新的定型產(chǎn)品無菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解決了這個難題，把薄膜放在培養(yǎng)瓶皿中，讓細(xì)胞直接長在塑料薄膜上，不僅細(xì)胞生長效果好，而且可與細(xì)胞一起包埋切片，省去了許多麻煩。
(二)超薄切片基本操作步驟
1、取材
(1)離心法 適用于懸浮生長細(xì)胞或單層生長細(xì)胞，欲觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞低速離心，令細(xì)胞沉于錐形離心管底部，吸除上清液，立即加戊二醛固定。
(2)原位法 將無菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包裝的成品)剪成適宜的小塊置入培養(yǎng)瓶中，然后接種細(xì)胞懸液，待細(xì)胞附于薄膜上并生長后，取出進(jìn)行固定。
1、固定
將離心管中的細(xì)胞團(tuán)塊或取出的薄膜移入青霉素小瓶中，在4℃用PBS漂洗3次，每次10分鐘。再用1% 四氧化鋨在4℃固定15～30分鐘，接著用PBS漂洗3次。
2、脫水
用系列丙酮在室溫下脫水。
50% 丙酮溶液1次，10分鐘。
70% 丙酮溶液1次，10分鐘。
90% 丙酮溶液2次，每次10分鐘。
100% 丙酮溶液3次，每次10分鐘。
3、浸透
吸棄瓶中脫水劑，加3mL純丙酮-EPON812包埋劑(1:1體積比)，室溫下放置30分鐘后，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1mL，室溫放置2小時或過夜。
5、包埋
(1)細(xì)胞團(tuán)塊 吸取混合包埋劑滴2滴于2號膠囊模塊孔的底部，把細(xì)胞團(tuán)塊移入膠囊底部中心，注滿混合包埋劑，放60℃烤箱烘烤2小時，使之固化成硬塊。
(2)細(xì)胞薄膜 將預(yù)先干燥的EPON明膠囊注滿混合包埋劑，倒蓋在單層細(xì)胞上，在60℃固化24小時。
6、修塊 將包埋塊安裝在特制的夾具上，在顯微鏡下用單刃刀片修整去除表面的包埋劑，并做記號以便定位。
7、切片 先將包埋塊固定在超薄切片機(jī)上，切厚約1μm的半薄切片，用蘇木素-伊紅染色法染色。鏡下觀察細(xì)胞圖像，確定進(jìn)行超薄切片的部位，并作標(biāo)記。準(zhǔn)備φ3mm，150～200目的銅網(wǎng)，用清洗液清洗，并用無水乙醇脫水干燥。制備好支持膜，小心放在銅網(wǎng)上。在超薄切片機(jī)上安裝三角形玻璃刀，固定包埋塊，切取50～70nm厚度的超薄切片，用睫毛筆挑選切片并用鋼絲環(huán)套取切片，貼在銅網(wǎng)有支持膜的一側(cè)，保存在干燥器皿中待染色。
8、電子染色：用一干凈培養(yǎng)皿，內(nèi)放干凈的牙科石蠟片。在石蠟片上加1至數(shù)滴醋酸鈉染色液，用鑷子夾住載網(wǎng)邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿染色5～30分鐘，染色后盡快用雙蒸水清洗三次。用濾紙吸去載網(wǎng)多余的水分，置培養(yǎng)皿內(nèi)自然干燥。再將載網(wǎng)放在另一只備有蠟片的培養(yǎng)皿中以同樣方法進(jìn)行檸檬酸鉛的染色及清洗。片染后涼干待觀察。
二、掃描電鏡細(xì)胞樣品制備
(一)原理
超薄切片實(shí)際上是樣品的二維切片，不能表達(dá)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，而且在觀察由切片所拍攝的顯微照片時，容易造成錯誤的印象。用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)能直接觀察標(biāo)本表面的三維空間結(jié)構(gòu)，真實(shí)地反映各種細(xì)胞表面和斷裂面的形貌特征。其照明源與透射電鏡基本相同，由電子槍發(fā)射的電子束經(jīng)聚光鏡會聚成極細(xì)的電子探針，電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面逐點(diǎn)逐線地掃描，樣品被電子轟擊所產(chǎn)生的二次電子被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。二次電子的發(fā)射量與樣品的表面形貌有關(guān)，從而在熒光屏上出現(xiàn)表面起伏的樣品的立體圖像。掃描電鏡細(xì)胞樣品的預(yù)處理包括取材、固定、脫水等。
(二)基本步驟
(1)取材 一般原則與超薄切片相似，但用于掃描電鏡觀察的樣品塊略大，通常為5×8mm左右。
(2)固定 鋪片培養(yǎng)的細(xì)胞取出浸入PBS中，漂洗細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預(yù)冷的3% 戊二醛，在4℃固定2小時或過夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10分鐘，再用4℃預(yù)冷的1% 鋨酸，在4℃固定1小時，然后用PBS浸洗2次，每次10分鐘。
(3)脫水 丙酮/醋酸異戊酯(1:1)10分鐘，接下來醋酸異戊酯30分鐘，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水，每種濃度酒精通過2次，每次15分鐘。
(4)干燥 以臨界干燥法最理想，但必需要有專門的儀器，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室不具備此種儀器時，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關(guān)鍵是乙腈置換。樣品經(jīng)上述處理后，浸入50%的乙腈水溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15～20分鐘，最后再換100%乙腈。然后進(jìn)行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺的空中置內(nèi)，抽低真空，一般需30～50分鐘。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時再放氣，取出樣品。
(5)樣品導(dǎo)電處理：用真空噴鍍法。所用儀器為真空噴鍍儀，樣品被安置在離蒸發(fā)源約10～15cm處的樣品臺上，樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)活動，先噴碳，后噴金，噴鍍應(yīng)均勻，完成后待鏡下觀察。
